Enterohemorragisk Escherichia coli (EHEC) är en gramnegativ bakterie som är en tarmpatogen och kan leda till allvarliga komplikationer som hemolytiskt uremiskt syndrom (HUS). Den viktigaste virulentfaktorn hos EHEC är shigatoxiner, vars gener detekteras vid diagnostik av EHEC med PCR-teknik. Ytterligare en betydande virulensfaktor hos EHEC är intimin som kodas av eaeA, som också ingår i EHEC-diagnostiken. Fler nya subtyper av eaeA har rapporterats, men kan inte identifieras med nuvarande metod. Nuvarande EHEC-protokoll saknar inhibitionskontroll (IC). Syftet med denna studie var att uppdatera det nuvarande PCR-protokollet för att kunna identifiera samtliga nu kända typer av eaeA, samt inkludera amplifiering av genfragment specifikt för E. coli som IC. Nya primers och prober för eaeA, som utformats av laboratoriet, testades för att uppnå optimala halter och amplifieringsprotokoll. För IC tillämpades primers och prober i bruk för annan diagnostik vid laboratoriet. Välkarakteriserad referensstam av E. coli användes vid optimering av det nya protokollet. Efter optimering av eaeA-protokollet inkluderas primers och prob för IC till multiplex realtids-PCR och ny optimering utfördes. För eaeA gav 0,1 µM av vardera primer och 0,05 µM prob den högsta känsligheten (103 CFU/ml) i kombination med 0,1 µM primer och 0,06 µM prob för IC. Det nya uppdaterade protokollet verifierades genom att testa totalt 115 prover besående av sparade stammar som analyserats vid referenslaboratoriet (Folkhälsomyndigheten), samt preparationer av kliniska material som tidigare hade analyserats vid laboratoriet med gällande PCR-protokoll. Det ny uppdaterade protokollet kunde detektera samtliga stammar och prover innehållande eaeA. För enstaka prover gav IC ingen produkt, varför dessa prover tolkades som inhiberade. Nya tester behöver utföras för att utreda vad som kan orsaka denna inhibition.

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) is a gram-negative bacterium that is a gastrointestinal pathogen and can lead to serious complications such as hemolytic uremic syndrome (HUS). The key virulence factor in EHEC is Shiga toxins, the genes of which are detected in EHEC diagnosis using PCR technology. Another significant virulence factor in EHEC is intimin, encoded by eaeA, which is also included in EHEC diagnostics. Several new subtypes of eaeA have been reported but cannot be identified using the current method. The current EHEC protocol lacks an inhibition control (IC). The aim of this study was to update the current PCR protocol to identify all known types of eaeA and include amplification of gene fragments specific to E. coli as IC. New primers and probes for eaeA, designed by the laboratory, were tested to achieve optimal concentrations and amplification protocols. For the IC, primers and probes already in use for other diagnostics in the laboratory were applied. A well-characterized reference strain of E. coli was used for optimizing the new protocol. After optimizing the eaeA protocol, primers and probes for the IC were included in the multiplex real-time PCR, and further optimization was performed. For eaeA, 0.1 µM of each primer and 0.05 µM of the probe provided the highest sensitivity (103 CFU/ml), in combination with 0.1 µM of primer and 0.06 µM of probe for the IC. The newly updated protocol was verified by testing a total of 115 samples, consisting of preserved strains analyzed at the reference laboratory (Public Health Agency of Sweden) and preparations of clinical material previously analyzed at the laboratory using the current PCR protocol. The newly updated protocol was able to detect all strains and samples containing eaeA. For a few samples, the IC did not yield any product, indicating inhibition. Further tests need to be conducted to investigate the cause of this inhibition.